金沙娱场城(61665-VIP认证)官网-Made in China

首页 新闻中心 企业动态
"菲"常有道 | 金沙娱场城61665免疫诊断试剂原料开发经验分享
7月20日,由全国体外诊断网(CAIVD)主办的《破势•免疫诊断试剂抗原抗体自研自产研讨会》云会议取得全满成功,金沙娱场城61665项目研发总监郭亮博士受邀参加了本次研讨会,并从不同检测方法学对核心原料的选择、抗原开发的核心问题及优化技巧、抗体开发过程中面临的问题及稳定性优化策略等内容分享了金沙娱场城61665对于免疫诊断试剂原料开发的认识和经验。

PART 01

不同检测方法学对核心原料的选择

目前常用的免疫检测方法包括四种:酶联免疫吸附试验(ELISA)化学发光免疫分析(CLIA)层析免疫分析(LFIA)乳胶增强比浊免疫分析(LETIA),不同的检测方法都遵循免疫反应的底层原理,即抗原抗体亲和反应,不同检测方法学对抗原抗体的应用方法不同,所以对抗原抗体的要求也不同。

如ELISA对于被固定或带检测标记物的抗原或抗体有很高的生物活性和纯度要求,抗体多采用单抗,一些厂商为提高抗体特异性,会采用酶切后的抗体片段如不包含Fc的F(ab')2片段。

CLIA既可采用单克隆抗体,也可采用多克隆抗体。但需要注意的是,由于我们通常使用的是兔抗或鼠抗原料,对某些临床样本会产生非特异性反应。因为样本中可能存在针对动物免疫球蛋白的抗体,所以会在双单克隆夹心法模式中产生假阳性现象。



PART 02

抗原开发的核心问题和优化技巧


在抗原开发过程中,蛋白质样品的纯度水平决定其对下游测试的影响,因此蛋白纯度一般是原料厂商最关心的核心问题。而蛋白表达纯化的得率检测中的活性原料的稳定性都与蛋白纯度有着密切关系,因此对蛋白纯化工艺的优化可从以上三方面进行考虑。


>>>>

包涵体的纯化和复性折叠策略

包涵体是蛋白表达过程中经常遇到的现象,如果我们无法通过优化蛋白表达来解决包涵体问题,只能通过摸索不同复性工艺,使蛋白重新折叠形成类似天然的二级结构。金沙娱场城61665在此分享几点在蛋白纯化过程中形成包涵体和对其复性折叠的策略

首先我们可通过同源蛋白数据模拟分析或其他已有的文献数据来了解目的蛋白的二级结构特点,之后根据二级结构来选择适合的复性溶解试剂,同时也要考虑溶解剂的去除对下游工艺或作为免疫原的影响,有时还需要将不同溶解剂串联使用,例如:使用提高pH促溶挂柱,洗脱后立即用带有DMSO的缓冲液中和pH,从而稳定复性后的正确折叠。

图源:Singh, A., Upadhyay, V., Upadhyay, A.K. et al. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact 14, 41 (2015).


>>>>

常用表面活性剂使用策略

在提取过程中使用表面活性剂也是提高抗原或抗体活性和稳定性的一种方法。金沙娱场城61665总结了不同表面活性剂的物理性质(如下图),在使用过程中需要从温度、类型、使用浓度、溶解目标和下游检测影响等进行综合考虑。例如:SDS是一种强阴离子表面活性剂,容易破坏蛋白,且难以去除,使用时需谨慎;Digitonin可溶解真核细胞膜,但不能溶解原核细胞膜;Triton X-100可溶解细菌内膜但不能溶解细菌外膜,此外,Triton X-100还能够吸收紫外线,对下游检测会有影响等。


PART 03

抗体开发过程中面临的问题

稳定性优化策略



原料厂商在抗体开发过程中经常会遇到免疫动物效价低、抗体阳性率高但亲和力不够以及抗体稳定性差等问题。虽然我们可以通过不同抗体发现路径找到活性高的抗体,但作为试剂开发的原料,抗体的稳定性起决定性作用。

抗体的稳定性品控可从浓度、纯度、活性和外观来考量。关于如何提高抗体的稳定性,金沙娱场城61665建议从抗体工程生产工艺优化两个方向进行优化。


此外,抗体稳定性评估还需要借助多种检测手段来综合分析。金沙娱场城61665总结了八种常用的抗体检测技术,如通过表面等离子体共振技术(SPR)分析发现,抗体的亲和力能够决定试剂检测的灵敏度;动态光散射(DLS)可用于考察抗体的稳定性;抗体纯度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、体积排阻色谱(SEC-HPLC)、十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)三种方式进行确认;毛细管等电聚焦电泳(CIEF)是检测分析抗体电荷异构体的有效手段。




常见问题解答
Q

A
抗原表达的构建设计有哪些优先考虑的建议?

抗原开发首先要熟悉目的蛋白信息,包括结构、功能和生理基质等,这些信息在构建设计时都可以利用或回避。另外,表达单一结构域还是全长、载体的选择和表达宿主的选择都是可以优先考虑的。例如,基于病原体靶蛋白的研究来选择结构域,或考虑表位筛选及选择嵌合表位来优势互补;选择合适融合蛋白也是常用的手段;如果表达的抗原在检测中出现假阳性或不稳定问题时,我们可通过突变修饰进行改善等等。

Q

A
试剂抗体也需要做人源化和Fc改造吗?

试剂抗体人源化不是必须的,人源化抗体理论上可以避免人抗鼠抗体(HAMA)效应的产生,具体来讲,将小鼠抗体进行人源化改造后,只有被改造抗体的CDR区是小鼠来源,抗体其他区域都是人源的。人源化抗体改造的目标是CDR移植,改造后的效果需要做大量实验来验证。同样Fc的改造也不是必须的,这种抗体分子改造方法目的是实现稳定性和功能性的改善。Fc改造是对抗体恒定区进行改造,是否需要Fc改造还要结合项目的具体应用场景来考虑。


金沙娱场城61665目前可提供完整的原料解决方案服务,如果您有免疫诊断试剂原料开发的需求,欢迎通过以下方式与金沙娱场城61665取得联系!


电话:0769-86089888

邮箱:marketcn@fapon.com